期刊：Cell Stem Cell
影响因子：23.9
主要技术：scRNA-seq
尽管小脑的早期发育阶段在不同物种之间具有保守性，但与非人哺乳动物相比，人类小脑发育具有独特之处，包括神经元亚型比例发生变化，以及叶状结构复杂性提升。近日，来自美国University of Southern California的Giorgia Quadrato研究组基于体内组织中心（isthmic organizer）发育所必需信号分子，设计了一套培养方案，可以实现在人源三维环境中，健康的小脑细胞，包括Purkinje神经元，发育成熟并长期生存。作者还发现，这套小脑类器官具有空间分隔的脑室和RL前体区，能够发展出胎儿小脑的复杂细胞多样性，包括在本研究之前从未在体外生成的人类特异性隆起唇前体细胞群。
1. HCerOs可以产生人类小脑的细胞多样性
使用双SMAD抑制剂Noggin和SB43154228以及典型的WNT通路激活剂CHIR-99021处理细胞聚集体。在第4天，FGF8b被添加到指定的中脑-后脑边界并抑制中脑命运，重新创建了在体内(图1A和1B)中看到的峡部组织中心。到第30天，hCerOs产生了空间分离的VZ区(KIRREL2)和RL (ATOH1)祖细胞区。(图1D )尾侧标记物如IRX3和GBX2的表达增加（图1C）。对来自3个2月龄个体类器官的14，947个细胞进行了单细胞RNA测序( scRNA-seq )。通过评估神经类器官的细胞类型组成和发育阶段的工具Vox Hunt ，将2月龄hCerO的scRNA-seq数据映射到Brain Span人类转录组数据集，发现数据集与受孕后12-24周( PCW )的初级脑样本相比，与CB的比例相关性最高(图1E )。这些发现最近也得到了独立分析的证实，为人脑类器官图谱的构建做出了贡献。从人类数据集中提取了差异表达基因(DEGs)，用于表征RLvz、RLsvz和中间区IZ，证实了hcero衍生细胞与人类数据集中发现的不同亚簇的转录组相似性。在整个数据集中看到了经典RL区marker的表达，包括MKI67、PAX6和LMX1A，正如在人类数据集中看到的那样。此外，WLS、SOX2和CRAYAB的表达主要在RLvz中表达，而EOMES、DPYD、GPC6、OTX2和BARHL1在RLsvz中表达水平较高。以上数据表明，此方案可重复地产生发育中的CB的所有主要细胞类型。2. HCerOs表现出有组织的层状分层，类似发育中的小脑扁桃体的EGL和PCL
在胎儿发育过程中，脑膜细胞释放的趋化因子SDF1a (又称CXCL12)，通过激活相应的CXCR4受体，引导GCPs沿软脑膜表面切向迁移。体内GCPs表达CXCR4，随着这些细胞成熟为GCs，它们失去CXCR4受体的表达，从而失去对SDF1a的敏感性，向远离软脑膜表面的径向迁移。但作者发现这种机制在2个月大的类器官中没有内在的调节。因此2个月大的HCerOs不能像在体内那样组织。通过染色发现在2个月大的类器官中，BARHL1+ GC祖细胞表达CXCR4，同时单细胞数据进一步证实了CXCR4在体内和在类器官中的表达模式的相似性（RNA表达）。从第30天至第60天，每3天向培养基中添加100 ng/mL的SDF1a，观察到BARHL1+和PAX6+细胞排列在类器官边缘附近，而SKOR2+出现在该层下方。当对浦肯野细胞区(CALB1+)和RL衍生物区(BARHL1+)进行共染色时，注意到在sdf1a处理的hCerOs中似乎有两个不同的层。之后作者在第60天停用SDF1a后，当类器官达到6个月大时，观察到GCs和浦肯野细胞混合在一起。3. HCerOs在长期培养中表现出功能成熟的网络活动，类似于体内小脑环路的模式
在细胞多样性和细胞结构特征之后，进一步研究类器官中是否存在自发活性网络。对2月大的hcero进行了基于活双光子显微镜的成像，在感染AAV8 GCAMP 6f病毒后（1.5ul病毒加入150ul培养基静置过夜），记录细胞内钙动态。通过对单细胞钙动力学进行无偏分析和分类，在hCerOs中发现了河豚毒素(TTX)敏感的Ca2+神经元钙信号，表明自发的神经元活动。这进一步表明，hcero不仅在细胞组成方面，而且在功能水平上也表现出高度的类器官到类器官的可重复性。4. 功能成熟的浦肯野神经元会在长期培养的hCerOs中发育形成
在类器官六个月大时感染了一个表达沉默视蛋白eOPN3的慢病毒 ，启动子是L7-PCP2，来评估浦肯野细胞在网络中的积极参与。PCP2在浦肯野细胞中选择性表达，marker。吸收光512nm。通过520nmLED刺激，抑制浦肯野细胞表达，导致类器官中钙活性水平升高，表明浦肯野细胞参与了该神经网络的功能。为了进一步研究这些神经元在一系列神经系统疾病中功能失调的功能。通过空间转录组学鉴定了6月龄hCerOs中的浦肯野细胞，通过表达经典的体内标记基因，如PCP2，DAB1，RORA和FOXP2，(图5A ~ 5C )，获得了这些神经元的空间定位。对6个月大的hCerOs进行了钙结合蛋白标记的成像，以确定浦肯野神经元的形态。我们的研究结果与钙成像分析和膜片钳数据一致，表明在6个月标记时存在钙结合蛋白标记的浦肯野神经元，具有明显的树枝状和多样化的形态，这与PCW 22至2854之间的胎儿组织中的人浦肯野细胞相似(图5M )
长期以来对人类小脑发育和疾病的研究一直受到没有良好模型的限制，在这项研究中，研究团队开发了一种人类小脑类器官（hCerO），能够发育出胎儿小脑复杂的细胞多样性，包括在此研究之前从未在体外生成的人类特异性菱唇（Rhombic lip）祖细胞群。培养的2个月大的hCerO形成独特的细胞结构特征，包括层状组织层，并在抑制性和兴奋性神经元之间建立功能连接，显示协调的网络活动。长期培养hCerO可以使浦肯野细胞健康存活和成熟，这些浦肯野细胞显示了功能性神经元的转录组学和电生理特征，解决了该领域的长期挑战。
参考文献：
Atamian A, Birtele M, Hosseini N, Nguyen T, Seth A, Del Dosso A, Paul S, Tedeschi N, Taylor R, Coba MP, Samarasinghe R, Lois C, Quadrato G. Human cerebellar organoids with functional Purkinje cells. Cell Stem Cell. 2024 Jan 4;31(1):39-51.e6. doi: 10.1016/j.stem.2023.11.013. PMID: 38181749.
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