mRNA项目文章|一个全新选择性的基于吡唑并嘧啶的ALKBH5抑制剂DDO-2728的发现

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期刊：Journal of Medicinal Chemistry

影响因子：7.3

伯豪技术服务：mRNA测序

导读

最近关于RNA修饰的研究表明，RNA在生物系统中起着至关重要的作用，不仅通过将遗传信息从DNA转移到蛋白质，而且调节各种生物进程。作为最丰富和保守的RNA修饰，m⁶A(N6甲基腺苷)首先在真核mRNA中被发现。越来越多的研究表明，m⁶A在调节RNA加工，剪接，成核，翻译和稳定性方面起重要作用，并且对各种人类疾病的进展至关重要。

m⁶A修饰的过程是动态和可逆的，受m⁶A甲基转移酶，m⁶A去甲基化酶和m⁶A结合蛋白调节。ALKBH5被确定为第二个m⁶A去甲基化酶，属于Fe（II）-2-酮戊二酸（2-OG）依赖性双加氧酶的AlkB家族，可以去甲基化单甲基或二甲基化腺苷。最近的研究表明，ALKBH5可以特异性地促进AML的发生发展以及白血病干细胞的自我更新，而对正常造血及血液干细胞的自我更新影响很小。这些结果表明ALKBH5是一个有希望的肿瘤药物开发靶向。近年来，ALKBH5抑制剂的发现引起了人们的广泛关注。本研究描述了一个全新选择性的基于吡唑并嘧啶的ALKBH5抑制剂DDO-2728的发现。DDO-2728能特异性抑制ALKBH5的去甲基化活性，增加m⁶A的整体水平，诱导细胞凋亡和周期阻滞。此外，DDO-2728在MV4-11异种移植瘤模型中表现出显著的体内活性。这些结果突出了靶向ALKBH5在癌症治疗中的潜力。

研究技术

mRNA测序

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研究设计图

通过虚拟筛选及生化验证发现一种有效的ALKBH5抑制剂。

吡唑并嘧啶 ALKBH5抑制剂的设计及构效关系(SAR)优化。

验证DDO-2728与 ALKBH5直接结合。

DDO-2728抑制 ALKBH5的机制研究。

DDO-2728升高AML细胞m⁶A水平及其抗增殖活性的研究。

DDO-2728靶向 ALKBH5-TACC3信号轴。

DDO-2728的体内抗肿瘤作用

研究结果

1. 通过虚拟筛选及生化验证发现一种有效的ALKBH5抑制剂。

为了鉴定ALKBH5抑制剂，使用ALKBH5与2-OG之间的复合物的晶体结构作为对接模型（Fig 1A），对Chemdiv和SPECS数据库中的化合物进行了基于结构的虚拟筛选。基于合适的结合模式和高对接得分，选择了若干种化合物进行购买，并通过荧光偏振（FP）分析测定了它们的活性（Fig 1B-C）。结果表明，化合物8539-0746在100μM的浓度下可以完全抑制m⁶A底物与ALKBH5的结合，IC50值为15.6μM，并且对FTO表现出良好的选择性（Fig 1D）。此外，通过基于PAGE的酶活实验评估了8539-0746对ALKBH5去甲基酶活性的抑制作用。结果也表明8539-0746具有中等的ALKBH5-去甲基酶抑制活性，但需要进一步优化（Fig 1E）。

2. 吡唑并嘧啶 ALKBH5抑制剂的设计及构效关系(SAR)优化。

通过对8539-0746两侧苯环的结构改造，最终得到化合物19（DDO-2728，IC50=2.97μM），与8539-0746相比，该化合物对ALKBH5具有6倍的改善效力，并且对FTO表现出良好的选择性（IC50＞200μM）。

3. 验证DDO-2728与 ALKBH5直接结合

ALKBH5和DDO-2728之间的直接相互作用通过多种测定得到验证。生物膜干涉（BLI）实验表明，DDO-2728以快结合和慢解离的方式与ALKBH5结合，平衡离解常数（KD）值为6.62μM（Fig 2A）。微量热涌动实验（MST）也表明化合物与ALKBH5蛋白结合（Fig 2B）。细胞内热漂移实验(CETSA)则验证了DDO-2728在细胞中的ALKBH5参与（Fig 2C）。

4. DDO-2728抑制 ALKBH5的机制研究

根据DDO-2728和ALKBH5蛋白的对接姿势，残基Arg130、Tyr139和Lys132对于DDO-2728与ALKBA5的结合是必需的。突变蛋白结合测定显示，将残基Arg130、Tyr139和Lys132分别突变为丙氨酸后，与野生型ALKBH5相比化合物的Kd值均有不同程度的降低（Fig 3A-C）。为了进一步验证DDO-2728与ALKBH5的结合不受2-OG的干扰，使用FP测定来检测DDO-2728和2-OG类似物竞争荧光探针的能力。如图所示，在测试浓度下，DDO-2728的ALKBH5抑制活性与2-OG浓度无关。而2OG类似物型抑制剂随着2-OG浓度的增加，抑制活性逐渐减弱（Fig 3D）。

5. DDO-2728升高AML细胞m⁶A水平及其抗增殖活性的研究

为了进一步探索了ALKBH5抑制剂DDO-2728的细胞活性。用DDO-2728处理AML细胞，并使用m⁶A点印迹和m6A RNA甲基化定量试剂盒检查RNA上m6A的变化。结果显示，DDO-2728可以在浓度梯度上增加MOLM-13细胞中的m6A甲基化水平（Fig 4A-D）。接下来，研究了DDO-2728对AML细胞的抗增殖作用。结果表明，DDO-2728抑制MOLM-13和MV4-11细胞的增殖（Fig 4E）。此外，DDO-2728在正常细胞HEK293和HUVECs中显示出相对较弱的毒性（Fig 4F）。流式细胞术的结果表明，用DDO-2728处理MOLM-13和MV4-11细胞48小时可显著诱导G1期细胞周期阻滞（Fig 4G）。同时，DDO-2728可以浓度依赖性地诱导细胞凋亡（Fig 4H）。

6. DDO-2728靶向 ALKBH5-TACC3信号轴

以前的研究表明，ALKBH5可以影响一些 mRNA 转录物的半衰期以发挥肿瘤促进作用。为了解决ALKBH5在AML中的分子机制，Shen等人通过整合组学方法在 AML 细胞中定位了 ALKBH5直接靶点。最后，验证了18个ALKBH5靶点，其中12个靶点受到ALKBH5的正调控，6个靶点受到ALKBH5的负调控。测试了DDO-2728对MOLM-13细胞转录组的影响。RNA-seq的结果显示，几乎所有在 AML 中证实的 ALKBH5的18个高置信度潜在靶标(18个基因中的17个)可以被DDO-2728调节（Fig 5A）。然后研究了DDO-2728对AML细胞ALKBH5-TACC3信号轴的影响。结果表明，用DDO-2728处理后，MOLM-13和 MV4-11中TACC3 mRNA的半衰期均降低（Fig 5B-C）。用DDO-2728处理MOLM-13和MV411细胞显着降低了mRNA和蛋白质水平上的TACC3和c-Myc的丰度（Fig 5D-G）。

7. DDO-2728的体内抗肿瘤作用

为了在体内检测DDO-2728对白血病的疗效，建立了MV4-11异种移植瘤模型。连续14天，每天向小鼠腹腔注射DDO-2728，测量并记录肿瘤生长和体重。结果显示，即使在10 mg/kg的浓度下，DDO-2728也能显著抑制肿瘤生长（Fig 6A-C）。在治疗过程中，小鼠的体重没有显著变化，试验组小鼠的器官重量与载体组相同（Fig 6D-E）。

参考文献:

Discovery of Pyrazolo[1,5-a]pyrimidine Derivative as a Novel and Selective ALKBH5 Inhibitor for the Treatment of AML.Ying-Zhe Wang, Hong-Yu Li, Yan Zhang, Rui-Xin Jiang, Jun Xu, Jing Gu, Zheng Jiang, Zheng-Yu Jiang, Qi-Dong You, and Xiao-Ke Guo. Journal of Medicinal Chemistry Article ASAP.

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