文献解读 | 单细胞分辨率下人类大脑皮层发育的基因调控动力学

DNA顺式调节元件转录因子(transcription factor, TF)可以通过结合方式驱动基因活性。这种变化是动态调控的，是发育过程中表型转化的基础。单细胞分辨率下检测染色质可及性(scATAC-seq)和转录组(scRNA-seq)，两种组学的结合可成为表观动态调控的敏感探针，从而探索转录因子驱动基因表达机制。

自闭症谱系障碍（autism spectrum disorder, ASD）相关的遗传变异如何干扰大脑皮层发育，目前该调控机制尚不清楚。

scRNA-seq、scATAC-seq

为了找到对皮质发育至关重要的基因集，本文除了绘制了基因调控元件的活性图谱，分别用单独建库方式和联合建库方式生成了“染色质可及性-基因表达”的单细胞图谱。

1.人类大脑皮质单细胞转录组和染色质开放区图谱构建

2.不同的转录因子调控是形成神经和形成胶质的基础

3.特定转录组因子的谱系在早阶段分化期可以激活染色体

4.神经网络非编码区突变导致自闭症谱系障碍

1. 人类大脑皮层发育过程单细胞调控图谱

为了检测大脑皮层中的细胞异质性，本文使用Chromium平台(10×Genomics)创建了一个基因调控图谱。分别用PCW16(受孕后16周)、PCW20、PCW21和PCW24的四个时间点的样本进行scATAC-seq和scRNA-seq。通过免疫荧光技术分析组织发育过程的空间异质性：CTIP2⁺细胞存在于大脑皮质板(cortical plate, CP)，SOX9⁺细胞存在于脑室区(ventricular zone, VZ)、脑室下区(subventricular zone, SVZ)和外侧脑室下区(outer SVZ, oSVZ)，而GFAP⁺支架横跨PCW17和PCW21的新皮层。基因表达和染色质开放情况相似，其动态变化与妊娠时间和细胞类型都有关。促皮质生成TFs如SOX9 、EOMES 、NEUROD2 和DLX2 ，在这三个指标在特异性的群里富集。本文根据两个组学的结果对差异TFs进行聚类分析，分别从“基因表达”和”基因活性”两个维度进行聚类展示。

2. scRNA-seq和scATAC-seq数据整合，两种方法证明“基因活性-表达”相关性

我们使用典型相关分析(canonical correlation analysis, CCA)将“基因活性评分”与“基因表达水平”相结合。除了scRNA-seq中的周期祖细胞群外，两个组学匹配的细胞群注释能对应。分别通过scRNA-seq(基因表达)和scATAC-seq(顺式调控元件(CRE)可及性)去鉴定区分的细胞类型。本文假设一组调节作用强的基因在皮层发育中起驱动作用。根据设定标准定义了一组“染色质可预测基因”基因集，其中包含185个基因。该基因集为定义标准：GPCs(基因活性-表达)相关性前十分之一的基因，且>10个CRE。该基因集显示在“TF本身活性”和“DNA结合TF活性”两方面显著富集。为了验证这些推断，设计PCW21人类皮层进行单细胞多组学的检测，即进行同一细胞同时进行scATAC-seq和scRNA-seq。通过对单细胞多组学的分析，证实细胞类型注释在多组学数据中得到了很好的印证。将前面提及”CRE可及性-基因表达”关联方法应用于真正的细胞匹配中，分析得到到40181个存在关联的基因（53%），并新增发现23849个。以上两种方法：1、CCA实现多组学数据联合分析；2、单细胞多组学实测分析，两中方法均说明了的GPCs的一致性，即“基因活性-表达”具有相关性。

3. 谷氨酸能神经元(GluN)发育过程中表观动态调控

分别用scRNA-seq和scATAC-seq的数据借助RNA速率分析，模拟随时间进程细胞群分化关系。基于基因活性-表达分析方法应用于研究谷氨酸能神经元谱系，我们确定了13989个基因在拟时间轨迹中存在动态调整，并将其分为五组表达模式。早期在拟时序中GPCs富集了抑制细胞分裂和抑制神经前体增殖的功能。为了证实发育过程中TFs参与到组织形态改变、细胞迁移和细胞成熟等环节，进一步鉴定了TFs对应结合的基序。在轨迹早期相互作用中富集的基序包括ZNF740、KLF16、SP1/2和ASCL1。发育过程中与TFs表达表同步的，激活的基序，从早期阶段PAX6、SOX2/6/9、GLI3和ASCL1基序开始，然后是中间阶段基序：EOMES、NFIA、NFIB、NEUROD1，最后是发育晚期基序：NEUROD2、BHLHE22、MEF2C。为了呈现TFs参与到大脑皮质发育形成的过程，整合基序家族和协同作用基因，展示二者的相关性。结果表明在神经发生的早期，基序的协调程度更高，通过较小的一组更独立的TFs调节促使神经元成熟。

4. 基于共表达的分析差异模块鉴定胶质前体细胞的两个亚群

我们使用模fuzzy c-means聚类进行了一项分析，构建共表达基因的模块。本文将这些细胞载量投影到分化的低维中展示（50个细胞/点）。为了理解这些基因模块，基于模块进行拟时序的分析，各群植根于周期特征的细胞群(“Cyc”)，且与发育早期相关；而“细胞分裂”、“祖细胞特征”等相关的基因，如TOP2A 、NR2F1 和NFIC 的表达也在拟时序早期达到峰值，并被对应到模块m10、m6和m3。而一些模块（m6、m8）横跨样本和阶段，表明该模块为持续表达程序。为了可视化模块的分化顺序，计算了模块的加权平均，结合伪批量和拟时序呈现模块关系。结果发现bHLH因子的基序ASCL1和NHLH1在模块m13中富集，而SOX21在m14中富集。为了进一步地了解这些模块的细胞间的差异，后续比较星形胶质细胞的两个分群，A1-HES和A2-OLIG的差异基因表达，分别对应于模块m2/14和m13的表达。结合以上结果基于表达的模块，鉴定了胶质前体细胞的两个亚群。

5. 基于染色体预测基因分析周期特征细胞群

细胞周期特征细胞群也是本文的研究重点，因此选择周期特征强的细胞群进行数据整合映射，同时通过fuzzy c-means降维作为伪批量分析。尽管我们在ATAC的伪批量中没有观察到明显的周期特征细胞群，但这些ATAC的伪批量样本通过映射到转录组，可以嵌入到周期特征的细胞群中。根据基因活性被划分为三个不同的分支，这三个分支由它们的scATAC-seq细胞群分配定义。我们观察到这些基因与一组GPCs（包括HES1 、RFX4 、OLIG1 、OLIG2 、NEUROD6 和EOMES ）有很强的重叠。总的来说，周期特征细胞的所有三个分支中的差异染色质活性基因都富集了GPCs。每个分支在前五差异基因中均会富集到bHLH-GPC-TF。通过分支的在拟时序中的映射结果，观察到样本在拟时序中分化发育的方向。这一结果表明，在发育早期周期特征细胞群中，染色质开放模式与GPCs的关联已经影响细胞群后续分化成熟的方向。

6. ASD深度学习模型显示破坏性非编码突变和ASD有关

利用 Simons Simplex Collection catalog数据库分析ASD中非编码基因的新突变，样本横跨1902个家族中，包括200,000个突变基因。同时结合BPNet框架用伪批量(scATAC-seq的降维)构建学习模型，通过卷积算法搭建神经网络。在计算模型中，发现一个极具破坏性的突变位于NFIA的内含子，其作为“功能丧失突变”曾被报道与ASD有关。该突变发生在NFIA靶基因的增强子中，且该增强子在不同类型的GluN细胞群中均有表达。

nIPC细胞群中，BPNet模型预测了一个破坏性的突变，该新突变和神经肽Y基因(NPY)相关的增强子相关，遇TSS相距90kb。NPY在亚板中表达以及在妊娠中期人类皮层的早期放射性胶质细胞(radial glia, RG)中，并且NPY受体的基因组缺失与ASD有关。

参考文献：

Trevino AE, Müller F, Andersen J, et al. Chromatin and gene-regulatory dynamics of the developing human cerebral cortex at single-cell resolution. Cell. 2021;184(19):5053-5069.e23. doi:10.1016/j.cell.2021.07.039